QBT2881-2007鞋类衬里和内垫材料抗菌技术条件
前 言
本标准是在参照国内外抗菌材料检测方法和鞋类相关标准的基础上制定的。
本标准的附录A、B、C均为规范性附录。
本标准由中国轻工业联合会提出。
本标准由全国制鞋标准化中心归口。
本标准由温州奥古斯都鞋业有限公司负责起草，参加起草单位为格瑞斯鞋业有限公司、泉州环球鞋服有限公司。
本标准主要起草人：李上辉、徐建存、李琼芳、郑苏江、欧阳友生、毛洁红。
本标准首次发布。
引 言
鞋类抗菌主要是对衬里和内垫材料进行抗菌处理并使之具备抗菌作用。通过使用抗菌衬里和抗菌内垫材料，构成具有抗菌作用的内腔表面，可抑制内腔表面微生物繁殖，改善穿着卫生条件，有助于提高人们的生活质量。为了促进产业发展。规范抗菌鞋材评价方法及提供技术依据，特制定本标准。[NextPage]
鞋类衬里和内垫材料抗菌技术条件
1 范围
本标准规定了抗菌鞋材的属于和定义、抗菌性能要求和试验方法。
本标准适用于表面具有抗菌作用的鞋类衬里和内垫材料。
本标准仅讨论鞋类的抗菌性能技术条件，不涉及其他功能。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 4789.2-2003 食品微生物学检验 菌落总数测定
GB/T 8629-2001 纺织品 试验用家庭洗涤和干燥程序
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1 抗菌 antimicrobial
采用化学或物理方法杀灭微生物或妨碍微生物生长繁殖及其活性的过程。
4 取样
4.1 取鞋材或成鞋制品若干，去除或裁剪出鞋垫，按附录A或附录B要求裁剪成相应数量、相应尺寸的样品。
若鞋垫材料不止一种，则根据不同材料分别采样、编号、测试。注意写点的抗菌测试面为其上表面（即直接与脚底接触的部分）。
4.2 将鞋材或成鞋制品从鞋帮处剪开，取衬里材料按附录A或附录B要求裁剪成相应数量、相应尺寸的样品。
若鞋面和衬里材料各自有独立的结构，则采样仅对衬里材料。
若衬里材料不止一种，则根据不用材料分别采样、编号、测试。注意协力的抗菌测试面为其下（内）表面（即直接与脚接触的部分）。
5 抗菌实验菌株
5.1 大肠杆菌（ATCC8099或ATCC25922）。
5.2 金黄色葡萄球菌（ATCC6538）。
5.3 白色念球菌（ATCC10231）。
5.4 根据用户需要选择的菌种。[NextPage]
6 抗菌性能检测方法
6.1 菌液吸收法
按附录A方法。
6.2 膜接触法
按附录B方法。
6.3 耐洗涤性测试
按附录C方法。
7 抗菌性能要求
鞋类衬里和内垫材料应全部满足表一的要求。
表1[NextPage] 附录A
（规范性附录）
菌液吸收法
A.1 原理
本方法通过待测样品定量吸收菌液，经过一定条件培养，测定样品中存活菌数，据此计算出样品的抗菌率。
A.2 试验条件
A.2.1 主要设备
A.2.1.1 恒温培养箱（37±1）℃、冷藏箱5℃-10℃、超净工作台、生物光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。
A.2.1.2 灭菌平皿、灭菌试管、灭菌移液管、灭菌三角瓶、接种环、酒精灯。
A.2.2 主要材料
A.2.2.1 标准空白对照样
空白对照样6组，为方便于比较，以是以测试微生物生长的纯棉白布为标准对照样，制成直径为（48±1）mm的圆片。每组样品所需叠合的圆布片数以吸入（1.0±0.1）mL菌液为宜。
标准空白对照按下列工艺制备：
纯棉白布→煮炼（NaOH 15g/L-20g/L，100℃，3h）→漂白（H2O2 3g/L-4g/L，100℃，3h）→洗涤10次（按附录C）→验证合格，方可采用。
A.2.2.2 抗菌鞋材样品
抗菌样3组，各有直径为（48±1）mm的原片叠合而成，每组样品的所需圆片片数以吸入（1.0±0.1）mL菌液为宜。如限于样品尺寸不能制成（48±1）mm，可多块拼凑以达到吸入菌液量的要求。
A.2.2.3 样品的灭菌
样品通常采用高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min。对于不耐热或高温湿热消毒法容易影响抗菌性能的样品，也可选用其他适宜的方法灭菌。
材料试验前灭菌处理以不影响材料/制品的抗菌性能为原则。
A.2.3 培养基和试剂
A.2.3.1 营养肉汤
将牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g加入1000mL蒸馏水中，加热溶解后，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH使灭菌后的pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌器，121℃灭菌20min。
A.2.3.2 营养琼脂培养基
将牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g和琼脂15.0g，加到1000mL蒸馏水或去离子水中，加热熔化，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH使灭菌后的pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20min。
A.2.3.3 马铃薯葡萄糖琼脂
将去皮切块的马铃薯300g，加1000mL蒸馏水，煮沸10min-20min。双层纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。然后加入葡萄糖20g，琼脂20g，加热熔化分装后置于压力蒸汽灭菌器，115℃灭菌20min。
A.2.3.4 平板计数琼脂
将酵母菌2.5g，胰蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，琼脂15g加入到1000mL蒸馏水或去离子水中，置于三角瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH为7.0-7.2（25℃），加上棉塞，置于压力蒸汽灭菌器，115℃灭菌20min。[NextPage]
A.2.3.5 鞋面培养基
将6mL-10mL加热溶解的营养琼脂加入试管，塞上棉塞并用高压蒸汽法灭菌。灭菌后的试管在洁净间中以水平面15°倾角放置让其凝固。若配好后不立即使用，应在5℃-10℃下保存。如没有冷凝水出现，应将其溶解，并凝固后使用。
A.2.3.6 磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L，pH7.2）
将无水磷酸氢二钠2.83g，磷酸二氢钾1.36g，加入到1000mL蒸馏水中，待完全溶解后，调节pH至7.2-7.4，分装后置于压力蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。
A.2.3.7 洗脱液
含0.85%NaCl的生理盐水。为便于洗脱加入少量无菌表面活性剂（如吐温80），用0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液调节pH,使灭菌后pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。
A.2.3.8 接种液
用生理盐水稀释肉汤，用于大肠杆菌的浓度为1/500，用于金黄色葡萄球菌的浓度为1/100，白色念球菌采用磷酸盐缓冲液配制。为便于微生物分散可加入少量的无菌表面活性剂（如吐温80）。用0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液调节pH，使灭菌后的接种液pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。
A.2.4 检验菌种
A.2.4.1 大肠杆菌（ATCC 8099或ATCC 25922）。
A.2.4.2 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）。
A.2.4.3 白色念球菌（ARCC10231）。
A.2.4.4 根据用户需要选择的菌种。
A.3 操作步骤
A.3.1 菌种保藏
将菌种接种于营养琼脂培养基上，在（37±1）℃下培养24h后，在5℃-10℃下保藏（不应超过1个月），作为斜面保藏菌。
A.3.2 菌种活化
将斜面保藏菌转接到平板营养琼脂培养基上，在（37±1）℃下培养24h，每天转接一次，不超过两周，试验时应采用连续转接2次后（在3-14代以内）的新鲜菌种培养物（24h内培养物）。
A.3.3 菌悬液制备
用4mm接种环从A.3.2培养基上取少量（刮1环-2环）新鲜菌种，加入接种液中；采用显微镜观察法或其他合适的方法估计细菌数目；梯度稀释并选择菌液浓度为（2.5-10.0）×10^5cfu/mL的稀释液作为试验用菌液。
A.3.4 样品试验
A.3.4.1 样品接种
将样品分别放于灭菌的培养皿中，然后准确移取（1.0±0.1）mL菌液均匀接种到样品上。将这些样品在无菌状态下转移到广口瓶中，盖紧瓶盖以防蒸发。
A.3.4.2 “0”接触时间的对照样、未接种试样的洗脱
接种后（“0”接触时间）尽快向对照样和未接种试样中加入（100±1）mL洗脱液。洗脱液应包括中和特定抗菌整理的组分，注意部分材料的pH要求。若找不到合适的中和剂，也可采用其他不影响试验结果的方法。
充分震荡1min，参考GB/T 4789.2-2003进行活菌计数。
A.3.4.3 样品接种后的培养和洗脱
将接种后的3组对照样和3组抗菌样在（37±1）℃条件下培养24h。培养结束后，在对照样和抗菌样的瓶中加入（100±1）mL洗脱液，震荡洗脱1min后，参考GB/T 4789.2-2003进行活菌计数。[NextPage]
A.4 评价
A.4.1 细菌数记录
如经10^0稀释度培养得到的活菌数为0，则极为＜100。
A.4.2 抗菌率计算
试验成立条件下，根据公式（A.1）计算抗菌样片的抗菌率，保留两位有效数字。
A-B
R=———×100……………………………………（A.1）
A
式中：
R——抗菌率，%；
A——经过24h培养的三个标准空白样的活菌数的平均值；
B——经过24h培养的三个抗菌样品的活菌数的平均数。
A.4.3 试验有效的条件
a） 未接种试样上的活菌数为0；
b） 接种培养后对照样上的活菌数不应低于0时间活菌数。[NextPage]
附录 B
（规范性附录）
膜接触法
B.1 原理
本方法通过接种定量微生物到待检测样品表面，用贴膜的方法使接种的微生物均匀接触样品表面，经一定时间培养后，测得样品中的活菌数，据此计算出样品的抗菌率。
B.2 试验条件
B.2.1 主要设备
B.2.1.1 恒温培养箱（37±1）℃、冷藏箱5℃-10℃、超净工作台、生物光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。
B.2.1.2 灭菌平皿、灭菌试管、灭菌移液管、灭菌广口玻璃瓶、接种环、酒精灯。
B.2.2 主要材料
B.2.2.1 覆盖膜
聚乙烯薄膜，标准尺寸为（40×20）mm×（40×20）mm、厚度为0.05mm-0.10mm；如试验样品外形尺寸较小，可按其面积减小覆盖膜尺寸，且保证样品覆盖膜部位所分布的菌数量不变。用70%乙醇溶液浸泡3min，再用无菌水冲洗，
自然干燥。
B.2.2.2 空白对照样
空白对照样6快，材质为医用级聚乙烯片，尺寸为（50×2）mm×（50×2）mm，厚度小于10mm，或与抗菌样片的尺寸相同。
B.2.2.3 抗菌鞋材样品
抗菌样3块，尺寸为（50×2）mm×（50×2）mm，厚度不大于5mm。若尺寸小于（50×2）mm×（50×2）mm，硬不小于20mm×20mm，且覆盖膜也相应减小。
B.2.2.4 样品的消毒
用酒精擦拭样片，并用无菌水冲洗：对于不适合酒精擦拭的样品也可选用其他适宜的方法灭菌。
材料试验前灭菌处理以不影响材料/制品的抗菌性能为原则。
B.2.3 培养基和试剂
B.2.3.1 营养肉汤
将牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g加入1000mL蒸馏水中，加热溶解后，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH使灭菌后的pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌器，121℃灭菌20min。
B.2.3.2 营养琼脂培养基
将牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g和琼脂15.0g，加到1000mL蒸馏水或去离子水中，加热熔化，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH使灭菌后的pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20min。
B.2.3.3 马铃薯葡萄糖琼脂
将去皮切块的马铃薯300g，加1000mL蒸馏水，煮沸10min-20min。双层纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。然后加入葡萄糖20g，琼脂20g，加热熔化分装后置于压力蒸汽灭菌器，115℃灭菌20min。
B.2.3.4 平板计数琼脂
将酵母菌2.5g，胰蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，琼脂15g加入到1000mL蒸馏水或去离子水中，置于三角瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH为7.0-7.2（25℃），加上棉塞，置于压力蒸汽灭菌器，115℃灭菌20min。[NextPage]
B.2.3.5 鞋面培养基
将6mL-10mL加热溶解的营养琼脂加入试管，塞上棉塞并用高压蒸汽法灭菌。灭菌后的试管在洁净间中以水平面15°倾角放置让其凝固。若配好后不立即使用，应在5℃-10℃下保存。如没有冷凝水出现，应将其溶解，并凝固后使用。
B.2.3.6 磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L，pH7.2）
将无水磷酸氢二钠2.83g，磷酸二氢钾1.36g，加入到1000mL蒸馏水中，待完全溶解后，调节pH至7.2-7.4，分装后置于压力蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。
B.2.3.7 磷酸盐缓冲生理盐水溶液
用浓度为0.85%的氯化钠溶液稀释磷酸盐缓冲溶液至体积比800倍。当使用此溶液时将其分装至试管或三角瓶中，塞上棉塞，然后用高压湿热法灭菌。
B.2.4 检验菌种
B.2.4.1 大肠杆菌（ATCC 8099或ATCC 25922）。
B.2.4.2 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）。
B.2.4.3 白色念球菌（ARCC10231）。
B.2.4.4 根据用户需要选择的菌种。
B.3 操作步骤
B.3.1 菌种保藏
将菌种接种于营养琼脂培养基上，在（37±1）℃下培养24h后，在5℃-10℃下保藏（不应超过1个月），作为斜面保藏菌。
B.3.2 菌种活化
将斜面保藏菌转接到平板营养琼脂培养基上，在（37±1）℃下培养24h，每天转接一次，不超过2周，试验时应采用连续转接2次后（在3-14代以内）的新鲜菌种培养物（24h内培养物）。
B.3.3 菌悬液制备
用生理盐水溶液稀释营养肉汤（NB）。用于大肠杆菌的浓度为1/500，用于金黄色葡萄球菌的浓度为1/100，白色念球菌采用磷酸盐缓冲液配置。为便于细菌分散可加入少量的无菌表面活性剂（如吐温80）。用0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液调节pH，使灭菌后的培养液pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。
将不走B.3.2中新鲜培养物取1环均匀分散到少量的1/500NB中，采用显微镜观察法或其它合适的方法估计细菌数目，并用1/500NB稀释菌液至细菌浓度为（2.5-10）×10^5cfu/mL，以此作为试验用菌液。若菌液不立即使用，将其冷冻至0℃，保存时间不超过4h。
B.3.4 试验菌液接种
将样片放入灭菌培养皿中，保持试验面朝上，用移液管准确量取菌悬液0.4mL，缓慢滴到每个样片表面。并将薄膜盖于菌液上，调节薄膜使菌液分散到整个薄膜，注意不要使菌液从薄膜边溢出，然后盖上培养皿的上盖。接种后的3个空白样应尽快洗脱。
B.3.5 接种后样片的细菌培养
将接种后放置3个抗菌样片和3个空白无加工样片的培养皿，在（37±1）℃相对湿度不小于90%的条件下培养24h
B.3.6培养后样片的洗脱
B.3.6.1 “0”接触时间样片的洗脱
分别量取20mL磷酸盐缓冲生理盐水洗脱液到3个“0”接触时间的空白对照样中，充分洗脱后，参考GB/T 4789.2-2003进行活菌计数。[NextPage]
B.3.6.2 培养后试验片的洗脱
对培养后样片的洗脱采用类似的方法进行，之后马上对洗脱液进行活菌计数。
B.3.6.3 活菌数计算
根据公式（B.1），由菌落计数得到活菌数。
N=C×D×V…………………………………………（B.1）
式中：
N——每样片的活菌数；
C——菌落数（2个培养皿的平均值）；
D——稀释倍数；
V——用于洗脱的缓冲液的体积，单位为毫升（mL）。
记录活菌数是取二位有效数字，第三位有效数字四舍五入。在V=20的情况下，对菌落数小于1的情况记为小于20.取活菌数的平均值时，对三个试验片的活菌数取算术平均值，结果保留两位有效数字，第三位有效数字四舍五入。当活菌数小于20时，此数作为20进行平均值计算。
B.3.6.4 评价
B.3.6.4.1 试验成立条件的判定
当下述三个条件都得到满足时，试验被判定有效。反之，则试验无效，应重新进行试验。
a）空白对照样品零接触时间的活菌数满足如下条件：
L最大-L最小
———————≤0.2
L平均
式中：
L最大——活菌数的最大对数值；
L最小——活菌数的最小对数值；
L平均——三个样片的活菌数对数的平均值。
b）零接触时间空白对照样的活菌平均值应为（1.0-4.0）×10^5个。
c）三个空白对照样经24h培养后的活菌数均不应小于1.0×10^4个。
B.3.6.4.2 抗菌率计算
试验成立条件下，根据式（B.2）计算抗菌率，保留两位有效数字。
A-B
R=———×100……………………………………（B.2）
A
式中：
R——抗菌率，%；
A——空白对照样24h培养后活菌数平均值；
B——抗菌加工样片24h培养后活菌数平均值。[NextPage]
附录C
（规范性附录）
鞋类衬里和内垫材料的洗涤试验方法
C.1 鞋类衬里和内垫材料的洗涤试验方法
参照GB/T 8629-2001。
C.2 设备和材料
C.2.1 洗衣机
B型家用全自动洗衣机（顶部加料、搅拌型）。
C.2.2 洗涤剂
使用标准洗涤剂。
AATCC 1993标准洗涤剂WOB（无磷配方、不含荧光增白剂）见表C.1。
表C.1C.3 标准化的洗涤条件和程序
C.3.1 洗涤程序参照GB/T 8629-2001中表6的“搅拌型洗衣机-B行洗衣机的洗涤程序”7B程序，洗涤时间为5min。
C.3.2 在洗衣机中使用C.2.2洗涤剂0.2%（即2.0g/L）及自来水，比例为1:30，水温（40±3）℃，投入试样，洗涤5min。然后，于常温下用清水清洗。
C.3.3 第一遍清洗2min，捞出织物，脱水30s。
C.3.4 第二遍清洗2min，捞出织物，脱水30s。
C.3.5 上述C.3.2，C.3.3，C.3.4三步为一个循环，计为洗涤1次。重复这三个步骤，知道预定的洗涤此数。为防止残留的洗涤剂干扰抗菌测试，注意最后一次洗涤采用大量的清水使其彻底清除，然后将织物脱水后烘干，即可用于抗菌性能测试。
本标准是在参照国内外抗菌材料检测方法和鞋类相关标准的基础上制定的。
本标准的附录A、B、C均为规范性附录。
本标准由中国轻工业联合会提出。
本标准由全国制鞋标准化中心归口。
本标准由温州奥古斯都鞋业有限公司负责起草，参加起草单位为格瑞斯鞋业有限公司、泉州环球鞋服有限公司。
本标准主要起草人：李上辉、徐建存、李琼芳、郑苏江、欧阳友生、毛洁红。
本标准首次发布。
引 言
鞋类抗菌主要是对衬里和内垫材料进行抗菌处理并使之具备抗菌作用。通过使用抗菌衬里和抗菌内垫材料，构成具有抗菌作用的内腔表面，可抑制内腔表面微生物繁殖，改善穿着卫生条件，有助于提高人们的生活质量。为了促进产业发展。规范抗菌鞋材评价方法及提供技术依据，特制定本标准。[NextPage]
鞋类衬里和内垫材料抗菌技术条件
1 范围
本标准规定了抗菌鞋材的属于和定义、抗菌性能要求和试验方法。
本标准适用于表面具有抗菌作用的鞋类衬里和内垫材料。
本标准仅讨论鞋类的抗菌性能技术条件，不涉及其他功能。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 4789.2-2003 食品微生物学检验 菌落总数测定
GB/T 8629-2001 纺织品 试验用家庭洗涤和干燥程序
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1 抗菌 antimicrobial
采用化学或物理方法杀灭微生物或妨碍微生物生长繁殖及其活性的过程。
4 取样
4.1 取鞋材或成鞋制品若干，去除或裁剪出鞋垫，按附录A或附录B要求裁剪成相应数量、相应尺寸的样品。
若鞋垫材料不止一种，则根据不同材料分别采样、编号、测试。注意写点的抗菌测试面为其上表面（即直接与脚底接触的部分）。
4.2 将鞋材或成鞋制品从鞋帮处剪开，取衬里材料按附录A或附录B要求裁剪成相应数量、相应尺寸的样品。
若鞋面和衬里材料各自有独立的结构，则采样仅对衬里材料。
若衬里材料不止一种，则根据不用材料分别采样、编号、测试。注意协力的抗菌测试面为其下（内）表面（即直接与脚接触的部分）。
5 抗菌实验菌株
5.1 大肠杆菌（ATCC8099或ATCC25922）。
5.2 金黄色葡萄球菌（ATCC6538）。
5.3 白色念球菌（ATCC10231）。
5.4 根据用户需要选择的菌种。[NextPage]
6 抗菌性能检测方法
6.1 菌液吸收法
按附录A方法。
6.2 膜接触法
按附录B方法。
6.3 耐洗涤性测试
按附录C方法。
7 抗菌性能要求
鞋类衬里和内垫材料应全部满足表一的要求。
表1[NextPage] 附录A
（规范性附录）
菌液吸收法
A.1 原理
本方法通过待测样品定量吸收菌液，经过一定条件培养，测定样品中存活菌数，据此计算出样品的抗菌率。
A.2 试验条件
A.2.1 主要设备
A.2.1.1 恒温培养箱（37±1）℃、冷藏箱5℃-10℃、超净工作台、生物光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。
A.2.1.2 灭菌平皿、灭菌试管、灭菌移液管、灭菌三角瓶、接种环、酒精灯。
A.2.2 主要材料
A.2.2.1 标准空白对照样
空白对照样6组，为方便于比较，以是以测试微生物生长的纯棉白布为标准对照样，制成直径为（48±1）mm的圆片。每组样品所需叠合的圆布片数以吸入（1.0±0.1）mL菌液为宜。
标准空白对照按下列工艺制备：
纯棉白布→煮炼（NaOH 15g/L-20g/L，100℃，3h）→漂白（H2O2 3g/L-4g/L，100℃，3h）→洗涤10次（按附录C）→验证合格，方可采用。
A.2.2.2 抗菌鞋材样品
抗菌样3组，各有直径为（48±1）mm的原片叠合而成，每组样品的所需圆片片数以吸入（1.0±0.1）mL菌液为宜。如限于样品尺寸不能制成（48±1）mm，可多块拼凑以达到吸入菌液量的要求。
A.2.2.3 样品的灭菌
样品通常采用高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min。对于不耐热或高温湿热消毒法容易影响抗菌性能的样品，也可选用其他适宜的方法灭菌。
材料试验前灭菌处理以不影响材料/制品的抗菌性能为原则。
A.2.3 培养基和试剂
A.2.3.1 营养肉汤
将牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g加入1000mL蒸馏水中，加热溶解后，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH使灭菌后的pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌器，121℃灭菌20min。
A.2.3.2 营养琼脂培养基
将牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g和琼脂15.0g，加到1000mL蒸馏水或去离子水中，加热熔化，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH使灭菌后的pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20min。
A.2.3.3 马铃薯葡萄糖琼脂
将去皮切块的马铃薯300g，加1000mL蒸馏水，煮沸10min-20min。双层纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。然后加入葡萄糖20g，琼脂20g，加热熔化分装后置于压力蒸汽灭菌器，115℃灭菌20min。
A.2.3.4 平板计数琼脂
将酵母菌2.5g，胰蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，琼脂15g加入到1000mL蒸馏水或去离子水中，置于三角瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH为7.0-7.2（25℃），加上棉塞，置于压力蒸汽灭菌器，115℃灭菌20min。[NextPage]
A.2.3.5 鞋面培养基
将6mL-10mL加热溶解的营养琼脂加入试管，塞上棉塞并用高压蒸汽法灭菌。灭菌后的试管在洁净间中以水平面15°倾角放置让其凝固。若配好后不立即使用，应在5℃-10℃下保存。如没有冷凝水出现，应将其溶解，并凝固后使用。
A.2.3.6 磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L，pH7.2）
将无水磷酸氢二钠2.83g，磷酸二氢钾1.36g，加入到1000mL蒸馏水中，待完全溶解后，调节pH至7.2-7.4，分装后置于压力蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。
A.2.3.7 洗脱液
含0.85%NaCl的生理盐水。为便于洗脱加入少量无菌表面活性剂（如吐温80），用0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液调节pH,使灭菌后pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。
A.2.3.8 接种液
用生理盐水稀释肉汤，用于大肠杆菌的浓度为1/500，用于金黄色葡萄球菌的浓度为1/100，白色念球菌采用磷酸盐缓冲液配制。为便于微生物分散可加入少量的无菌表面活性剂（如吐温80）。用0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液调节pH，使灭菌后的接种液pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。
A.2.4 检验菌种
A.2.4.1 大肠杆菌（ATCC 8099或ATCC 25922）。
A.2.4.2 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）。
A.2.4.3 白色念球菌（ARCC10231）。
A.2.4.4 根据用户需要选择的菌种。
A.3 操作步骤
A.3.1 菌种保藏
将菌种接种于营养琼脂培养基上，在（37±1）℃下培养24h后，在5℃-10℃下保藏（不应超过1个月），作为斜面保藏菌。
A.3.2 菌种活化
将斜面保藏菌转接到平板营养琼脂培养基上，在（37±1）℃下培养24h，每天转接一次，不超过两周，试验时应采用连续转接2次后（在3-14代以内）的新鲜菌种培养物（24h内培养物）。
A.3.3 菌悬液制备
用4mm接种环从A.3.2培养基上取少量（刮1环-2环）新鲜菌种，加入接种液中；采用显微镜观察法或其他合适的方法估计细菌数目；梯度稀释并选择菌液浓度为（2.5-10.0）×10^5cfu/mL的稀释液作为试验用菌液。
A.3.4 样品试验
A.3.4.1 样品接种
将样品分别放于灭菌的培养皿中，然后准确移取（1.0±0.1）mL菌液均匀接种到样品上。将这些样品在无菌状态下转移到广口瓶中，盖紧瓶盖以防蒸发。
A.3.4.2 “0”接触时间的对照样、未接种试样的洗脱
接种后（“0”接触时间）尽快向对照样和未接种试样中加入（100±1）mL洗脱液。洗脱液应包括中和特定抗菌整理的组分，注意部分材料的pH要求。若找不到合适的中和剂，也可采用其他不影响试验结果的方法。
充分震荡1min，参考GB/T 4789.2-2003进行活菌计数。
A.3.4.3 样品接种后的培养和洗脱
将接种后的3组对照样和3组抗菌样在（37±1）℃条件下培养24h。培养结束后，在对照样和抗菌样的瓶中加入（100±1）mL洗脱液，震荡洗脱1min后，参考GB/T 4789.2-2003进行活菌计数。[NextPage]
A.4 评价
A.4.1 细菌数记录
如经10^0稀释度培养得到的活菌数为0，则极为＜100。
A.4.2 抗菌率计算
试验成立条件下，根据公式（A.1）计算抗菌样片的抗菌率，保留两位有效数字。
A-B
R=———×100……………………………………（A.1）
A
式中：
R——抗菌率，%；
A——经过24h培养的三个标准空白样的活菌数的平均值；
B——经过24h培养的三个抗菌样品的活菌数的平均数。
A.4.3 试验有效的条件
a） 未接种试样上的活菌数为0；
b） 接种培养后对照样上的活菌数不应低于0时间活菌数。[NextPage]
附录 B
（规范性附录）
膜接触法
B.1 原理
本方法通过接种定量微生物到待检测样品表面，用贴膜的方法使接种的微生物均匀接触样品表面，经一定时间培养后，测得样品中的活菌数，据此计算出样品的抗菌率。
B.2 试验条件
B.2.1 主要设备
B.2.1.1 恒温培养箱（37±1）℃、冷藏箱5℃-10℃、超净工作台、生物光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。
B.2.1.2 灭菌平皿、灭菌试管、灭菌移液管、灭菌广口玻璃瓶、接种环、酒精灯。
B.2.2 主要材料
B.2.2.1 覆盖膜
聚乙烯薄膜，标准尺寸为（40×20）mm×（40×20）mm、厚度为0.05mm-0.10mm；如试验样品外形尺寸较小，可按其面积减小覆盖膜尺寸，且保证样品覆盖膜部位所分布的菌数量不变。用70%乙醇溶液浸泡3min，再用无菌水冲洗，
自然干燥。
B.2.2.2 空白对照样
空白对照样6快，材质为医用级聚乙烯片，尺寸为（50×2）mm×（50×2）mm，厚度小于10mm，或与抗菌样片的尺寸相同。
B.2.2.3 抗菌鞋材样品
抗菌样3块，尺寸为（50×2）mm×（50×2）mm，厚度不大于5mm。若尺寸小于（50×2）mm×（50×2）mm，硬不小于20mm×20mm，且覆盖膜也相应减小。
B.2.2.4 样品的消毒
用酒精擦拭样片，并用无菌水冲洗：对于不适合酒精擦拭的样品也可选用其他适宜的方法灭菌。
材料试验前灭菌处理以不影响材料/制品的抗菌性能为原则。
B.2.3 培养基和试剂
B.2.3.1 营养肉汤
将牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g加入1000mL蒸馏水中，加热溶解后，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH使灭菌后的pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌器，121℃灭菌20min。
B.2.3.2 营养琼脂培养基
将牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g和琼脂15.0g，加到1000mL蒸馏水或去离子水中，加热熔化，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH使灭菌后的pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20min。
B.2.3.3 马铃薯葡萄糖琼脂
将去皮切块的马铃薯300g，加1000mL蒸馏水，煮沸10min-20min。双层纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。然后加入葡萄糖20g，琼脂20g，加热熔化分装后置于压力蒸汽灭菌器，115℃灭菌20min。
B.2.3.4 平板计数琼脂
将酵母菌2.5g，胰蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，琼脂15g加入到1000mL蒸馏水或去离子水中，置于三角瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH为7.0-7.2（25℃），加上棉塞，置于压力蒸汽灭菌器，115℃灭菌20min。[NextPage]
B.2.3.5 鞋面培养基
将6mL-10mL加热溶解的营养琼脂加入试管，塞上棉塞并用高压蒸汽法灭菌。灭菌后的试管在洁净间中以水平面15°倾角放置让其凝固。若配好后不立即使用，应在5℃-10℃下保存。如没有冷凝水出现，应将其溶解，并凝固后使用。
B.2.3.6 磷酸盐缓冲液（PBS，0.03mol/L，pH7.2）
将无水磷酸氢二钠2.83g，磷酸二氢钾1.36g，加入到1000mL蒸馏水中，待完全溶解后，调节pH至7.2-7.4，分装后置于压力蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。
B.2.3.7 磷酸盐缓冲生理盐水溶液
用浓度为0.85%的氯化钠溶液稀释磷酸盐缓冲溶液至体积比800倍。当使用此溶液时将其分装至试管或三角瓶中，塞上棉塞，然后用高压湿热法灭菌。
B.2.4 检验菌种
B.2.4.1 大肠杆菌（ATCC 8099或ATCC 25922）。
B.2.4.2 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）。
B.2.4.3 白色念球菌（ARCC10231）。
B.2.4.4 根据用户需要选择的菌种。
B.3 操作步骤
B.3.1 菌种保藏
将菌种接种于营养琼脂培养基上，在（37±1）℃下培养24h后，在5℃-10℃下保藏（不应超过1个月），作为斜面保藏菌。
B.3.2 菌种活化
将斜面保藏菌转接到平板营养琼脂培养基上，在（37±1）℃下培养24h，每天转接一次，不超过2周，试验时应采用连续转接2次后（在3-14代以内）的新鲜菌种培养物（24h内培养物）。
B.3.3 菌悬液制备
用生理盐水溶液稀释营养肉汤（NB）。用于大肠杆菌的浓度为1/500，用于金黄色葡萄球菌的浓度为1/100，白色念球菌采用磷酸盐缓冲液配置。为便于细菌分散可加入少量的无菌表面活性剂（如吐温80）。用0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液调节pH，使灭菌后的培养液pH为7.0-7.2，分装后置于压力蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。
将不走B.3.2中新鲜培养物取1环均匀分散到少量的1/500NB中，采用显微镜观察法或其它合适的方法估计细菌数目，并用1/500NB稀释菌液至细菌浓度为（2.5-10）×10^5cfu/mL，以此作为试验用菌液。若菌液不立即使用，将其冷冻至0℃，保存时间不超过4h。
B.3.4 试验菌液接种
将样片放入灭菌培养皿中，保持试验面朝上，用移液管准确量取菌悬液0.4mL，缓慢滴到每个样片表面。并将薄膜盖于菌液上，调节薄膜使菌液分散到整个薄膜，注意不要使菌液从薄膜边溢出，然后盖上培养皿的上盖。接种后的3个空白样应尽快洗脱。
B.3.5 接种后样片的细菌培养
将接种后放置3个抗菌样片和3个空白无加工样片的培养皿，在（37±1）℃相对湿度不小于90%的条件下培养24h
B.3.6培养后样片的洗脱
B.3.6.1 “0”接触时间样片的洗脱
分别量取20mL磷酸盐缓冲生理盐水洗脱液到3个“0”接触时间的空白对照样中，充分洗脱后，参考GB/T 4789.2-2003进行活菌计数。[NextPage]
B.3.6.2 培养后试验片的洗脱
对培养后样片的洗脱采用类似的方法进行，之后马上对洗脱液进行活菌计数。
B.3.6.3 活菌数计算
根据公式（B.1），由菌落计数得到活菌数。
N=C×D×V…………………………………………（B.1）
式中：
N——每样片的活菌数；
C——菌落数（2个培养皿的平均值）；
D——稀释倍数；
V——用于洗脱的缓冲液的体积，单位为毫升（mL）。
记录活菌数是取二位有效数字，第三位有效数字四舍五入。在V=20的情况下，对菌落数小于1的情况记为小于20.取活菌数的平均值时，对三个试验片的活菌数取算术平均值，结果保留两位有效数字，第三位有效数字四舍五入。当活菌数小于20时，此数作为20进行平均值计算。
B.3.6.4 评价
B.3.6.4.1 试验成立条件的判定
当下述三个条件都得到满足时，试验被判定有效。反之，则试验无效，应重新进行试验。
a）空白对照样品零接触时间的活菌数满足如下条件：
L最大-L最小
———————≤0.2
L平均
式中：
L最大——活菌数的最大对数值；
L最小——活菌数的最小对数值；
L平均——三个样片的活菌数对数的平均值。
b）零接触时间空白对照样的活菌平均值应为（1.0-4.0）×10^5个。
c）三个空白对照样经24h培养后的活菌数均不应小于1.0×10^4个。
B.3.6.4.2 抗菌率计算
试验成立条件下，根据式（B.2）计算抗菌率，保留两位有效数字。
A-B
R=———×100……………………………………（B.2）
A
式中：
R——抗菌率，%；
A——空白对照样24h培养后活菌数平均值；
B——抗菌加工样片24h培养后活菌数平均值。[NextPage]
附录C
（规范性附录）
鞋类衬里和内垫材料的洗涤试验方法
C.1 鞋类衬里和内垫材料的洗涤试验方法
参照GB/T 8629-2001。
C.2 设备和材料
C.2.1 洗衣机
B型家用全自动洗衣机（顶部加料、搅拌型）。
C.2.2 洗涤剂
使用标准洗涤剂。
AATCC 1993标准洗涤剂WOB（无磷配方、不含荧光增白剂）见表C.1。
表C.1C.3 标准化的洗涤条件和程序
C.3.1 洗涤程序参照GB/T 8629-2001中表6的“搅拌型洗衣机-B行洗衣机的洗涤程序”7B程序，洗涤时间为5min。
C.3.2 在洗衣机中使用C.2.2洗涤剂0.2%（即2.0g/L）及自来水，比例为1:30，水温（40±3）℃，投入试样，洗涤5min。然后，于常温下用清水清洗。
C.3.3 第一遍清洗2min，捞出织物，脱水30s。
C.3.4 第二遍清洗2min，捞出织物，脱水30s。
C.3.5 上述C.3.2，C.3.3，C.3.4三步为一个循环，计为洗涤1次。重复这三个步骤，知道预定的洗涤此数。为防止残留的洗涤剂干扰抗菌测试，注意最后一次洗涤采用大量的清水使其彻底清除，然后将织物脱水后烘干，即可用于抗菌性能测试。
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